关键字：几丁质︱几丁聚醣︱生产制造︱检测︱应用

一、前言

几丁质、几丁聚醣是一种多功能、对环境友善的现代材料(Zakaria et al., 1995)，此等物质有生物兼容性(毒性低、不会产生抗体等)、生物活性(降胆固醇、降血脂、降血压、增加免疫功能)、成膜性、成胶性、在酸性溶液带正电(抗菌、吸附、止血) 等特性，因此可当做伤口敷料、贴布、手术缝合线、抗菌防臭布料、保健食品、减肥食品、固定化酵素担体、化妆品，亦可做为果汁澄清剂、水果保鲜剂、废水处理剂等。几丁质、几丁聚醣普遍应用在农业、医药、食品、化工、环保等领域，故全世界无论是已开发或开发中国家均对此等物质积极进行研究。有鉴于世界各国对几丁质、几丁聚醣的积极研究与开发利用，也基于虾蟹甲壳类是台湾的重要渔业加工废弃物，如不加以利用，很容易产生恶臭而造成环境污染。且虾蟹加工废弃物富含蛋白质、虾红素、几丁质、钙等有价值的成分，加以回收利用，可产生高附加价值之物质。几丁质、几丁聚醣原料的另一重要来源是生资(biomass)，我国有很好的发酵工业，这些生资之利用除了可以解决废弃物问题，减少对环境之冲击，也可以达到资源永续利用、绿色台湾之理想。

「几丁质、几丁聚醣的生产制造、检测与应用」之整合型计划，前后二期计有六年，共五十个子计划，承蒙国科会鼎力支持并补助新台币参仟肆佰万元，到目前为止之成果计有：发表研究报告九十二篇(其中三十八篇发表在SCI 刊物、二十一篇于非SCI 刊物、三十一篇国际与国内研讨会会议纪录)、二项专利案、一件技术转移案、三项建教合作案，举办一次国际会议暨第三届亚太几丁质几丁聚醣会议(Third Asia-Pacific Chitin and Chitosan Symposium)，共有来自十八个国家的国外八十余人与国内近百人的学者、专家、厂商代表与会，为期三天，共发表九十篇论文，其中大会邀请论文十篇、口头报告二十九篇、墙报式报告五十一篇，出版专书一本(Chen and Chen, 1999a)。以下简述本整合型计划到目前为止之研究成果。

二、研究成果

(一)生产制造技术方面

1. 原料储存技术有关之研究成果

几丁质、几丁聚醣与几丁寡醣之制备，可以利用目前台湾地区冷冻虾加工之废弃物，如未处理之虾壳废弃物，或脱水、细碎之虾壳废弃物。未处理之虾壳废弃物用酸液浸泡，可以储存在室温十天以上(陈荣辉，民88)。

2. 用化学法制备几丁质、几丁聚醣与几丁寡醣

以回应曲面法探讨由虾壳废弃物制备几丁质之最适条件，由几丁质制备几丁聚醣之最适条件，并探讨制备过程中之反应动力现象。由省产大头红虾壳废弃物用化学法制备几丁质与几丁聚醣的最适条件分别为去碳酸钙：常温、约1.7N 的盐酸、9 ml 酸液/g 虾壳粉；去蛋白质：约75°C 、2.5N 的氢氧化钠溶液、流动良好的碱液用量；去乙酰反应：约107°C、60%的氢氧化钠溶液，结果可用于回收虾壳废弃物中之有效物质，提高制造几丁质之效率，并有助于控制所制造几丁聚醣之特性(Chang and Tsai, 1997; Chang et al.,1997)。以盐酸水解几丁质或几丁聚醣制备几丁寡醣及运用HPLC分析寡醣之方法(张克亮等，民89a)，若欲制备较高聚合度之寡醣，除提高酸液浓度外，亦须缩减反应时间，而高温则容易生成较小之寡醣。制备较高分子量几丁寡醣之最适化条件为在约60°C、以高浓度酸液进行约一小时的短时间作用。几丁聚醣经盐酸水解后可得到较多几丁寡醣，但需约三小时之较长时间(张克亮等，民89)。另外也探讨由鱿鱼加工废弃物之软骨部分制备几丁质和几丁聚醣之方法，以及用氧化降解法制备几丁寡醣之方法。(张克亮，民89;Chang et al., 2001)。

3. 以虾蟹壳废弃物做为微生物碳源生产酵素

直接利用虾蟹壳废弃物做为微生物生产酵素之主要碳源，以市售之廉价虾蟹壳粉(shrimp and crab shell powder, SCSP) 为主要碳源，由新竹南寮渔港土壤筛选到一个耐碱性之几丁质酶生产菌Pseudomonas aeruginosa K-187 (Wang et al., 1995)。不仅虾蟹壳粉, 就连酸碱处理过之虾蟹壳粉或酸碱废液亦能被用来做为生产几丁质酶之主要碳源(Wang et al., 1997a; Wang and Hwang, 1999)。以酸/碱处理过之虾蟹壳粉比未处理之虾蟹壳粉更适于用来做为P. aeruginosa K-187 菌生产几丁质酶之主要碳源。此菌所生产之两种几丁质酶经进一步分离纯化结果，证明系为最先被发现源自微生物之双机能几丁质酶/溶菌酶(bifunctional chitinases/lysozymes) (Wang and Chang, 1997; Wang et al., 1997b;王三郎，民88)。P. aeruginosa K-187 菌发酵虾蟹壳所得之发酵液里，除了含有具抗细菌效果之几丁质酶之外，尚含对植物病原霉菌具抗菌效果之其它成分。此一抗霉菌成分经分离纯化结果，证明系为分子量66kDa 之高分子复合醣类，并且将之命名为pafungin (Wang and Yieh, 1999; Wang et al., 1999a, 1999b)。P. aeruginosa K-187菌所生产几丁质酶可共价键结于简称(hydroxypropyl methylcellulose acetate succinate) AS-L 的这种能随pH值变化而改变可溶性的高分子聚合物上。酵素活性之固定化率可高达百分之九十九，而活化能则由原先游离酵素之9.9 Kcal/g/mol降为5.96Kcal/g/mol 。最适反应pH 及温度则分别移至pH 8 及50°C。于半衰期(4°C) 方面，游离酵素为九天，而固定化之后则延长为十三天。经过十次批式之几丁质水解反应后，固定化几丁质酶仍持有原有(反应前) 活性之百分之七十。此菌所生产几丁质酶经固定化后，仍具有原先之抗菌(溶菌酶) 活性(Wang and Chio, 1997, 1998a, 1998b)。另外亦发现，此菌所生产之pafungin亦能被固定化于此种担体，而且维持所具之抗菌活性。P. aeruginosa K-187 菌发酵虾蟹壳废弃物所得之发酵液里，除了含有上述两种具抗细菌活性的几丁质酶，以及对于植物病原霉菌具有抗菌效果的pafungin 之外，尚具能够用来进行虾蟹壳去蛋白质之用的蛋白质酶活性(Wang et al., 1999c)。利用此菌所生产之蛋白质酶，经由微生物发酵法进行虾蟹壳去蛋白质实验时发现，当以固态培养方式进行去蛋白质时，对于虾蟹壳粉及天然虾壳之去蛋白质率，分别为百分之六十八及百分之八十二。此结果比已往所发表利用Pseudomonas maltophilia 之去蛋白质率还高(Wang etal., 1999c; Yang et al., 2000)。另外，本研究亦筛选到能发酵虾蟹壳废弃物之数株细菌Bacillus spp.，除了进行所生产蛋白质酶之分离纯化及虾蟹壳去蛋白质试验之外(Oh et al., 2000)，亦针对所生产之几丁质酶进行分离纯化(Wang and Hwang, 2001)。

4.以微生物降解虾壳生产几丁质、几丁聚醣及几丁寡醣

大头红虾、龙虾及红蟳的壳以化学法及生物法制取几丁质。大头红虾之几丁质纯度最高，化学法及生物法分别为94.8 及95.2% (干重，未脱色)。化学法所得各几丁质之5%氯化锂/二甲基乙酰胺(LiCl/DMAC)溶解度，大头红虾为19.0% 、红蟳为18.7% 、龙虾为
6.9% 。用微生物可以水解虾壳上的蛋白质而得到几丁质，虽然其纯度(96%) 略低于以强碱处理所得的几丁质，但去聚合化及去乙酰化较缓和，所得之几丁质较适于做生物医材之原料。以Pseudomonas maltophilia 1-1 或Candida parapsilosis CCRC 20515发酵去钙后的虾壳，可分离几丁质(92~95%)。其废液可做为微生物培养基及有机液肥。自环境中分离出会产生几丁质酶的细菌， 包括seudomonas maltophilia 1-1 、Cellulomonas flavigena NTOU 1、Aeromonas caviae D1 及Alteromonas haloplanktis K12。P. maltophilia 1-1以0.38 %(w/v) pH 8.39的K2HPO4为基础培养基发酵三天，将去钙的虾壳中的蛋白质水解，而得到几丁质含量达98% (干重) 的残留物(陈幸臣与许嘉珍，民86)。

另外，也从土壤中分出一株Flavobacterium sp. 能将几丁质的乙酰化程度由74 % 降低为64 % 。以生物法制取未脱色的几丁质(干重98.3，乙酰度为75.9%，分子量为3.8 x 106) 为原料，以Amycolatopsis orientalis的部分纯化几丁质酶加以水解以制取乙酰几丁六糖，每毫升水溶液可得1 . 4 9 毫克的N-乙酰几丁六糖(GlcNAc)6 ，即每克未脱色的大头红虾几丁质可获得七十四毫克的(GlcNAc)6。C. flavigena 会产生N-乙酰葡糖胺酶及几丁二糖酶(Chen et al., 1997)。A. caviae会产生N-乙酰葡糖胺酶、几丁二糖酶及几丁三糖酶，而A. haloplanktis 会产生N-乙酰葡糖胺酶及其它几丁质酶。利用分子生物技术，以A. caviae 的重组几丁质
酶(Lin et al., 1997, 1999) 生产N-乙酰几丁寡醣(一糖至六糖)。以微生物水解水产废弃物分离几丁质时，发现能水解虾壳蛋白质的微生物(如P. maltophilia 及Candida parapsilosis) 不能水解鱿鱼鞘之蛋白质。经由酵素水解及电子显微镜观察，发现鱿鱼鞘外壳包裹一层胶原蛋白。

5. 水溶性几丁聚醣之制备技术

1)利用梅纳反应或酵素转酰基与果胶结合制备水溶性几丁聚醣

几丁聚醣可与葡萄糖等还原醣经梅纳反应可得46%至28%水溶性几丁聚醣，溶解度在0.32 到1.0 g/dl之间，亦可经由果胶酯酶之转酰基反应与果胶分子结合，可以改善几丁聚醣之水溶性，但产率、溶解度均较上述反应低。

2)以酵素法制备低分子量水溶性几丁聚醣

几丁聚醣(去乙酰度65%及80%) 醋酸盐溶液可利用商品胃蛋白酵素及枯草菌血纤维蛋白酵素粗制品快速水解，粗胃蛋白酵素水解几丁聚醣之最终产物主要为分子量30000 左右之低分子量几丁聚醣，而枯草菌血纤维蛋白酵素水解几丁聚醣之最终产物则为几丁寡醣。两种酵素水解几丁聚醣之最适pH 为2 至4 ，粗胃蛋白酵素之最适温度为70 至80°C，而粗枯草杆菌血纤维蛋白酵素之最适温度为30 至40°C。两种商品蛋白酵素经系列步骤纯化可得到几丁聚醣酵素(Chang etal., 1999)。

枯草蛋白酶粗酵素制品可应用于降解几丁聚醣，制备几丁寡醣，所制备几丁寡醣之组成为几丁二醣至四醣以及若干较高聚合度之几丁寡醣(廖玉满等，民89)。市售菠萝茎蛋白酶粗酵素制品可应用于降解几丁聚醣，制备不同低分子量几丁聚醣(黏度平均分子量108至2.1 KDa)。

3)以物理及物化方法制备水溶性几丁聚醣以各种物理及物化方法包括剪力、超音波、剪力超音波合并、热与尿素、热/尿素与超音波五种方法处理可得水溶性几丁聚醣(陈荣辉等，民87)。用物理及物化方法制备之水溶性几丁聚醣，去乙酰程度、分子量可以控制外(Chen et al., 1996a, 1996c, 1996d,1998a)，分子量可高达九十万道尔敦，操作简单，不必使用强酸强碱、有机溶剂，收率高，甚至可以此等方法得到几丁寡醣。水溶性的几丁聚醣之流体行为是非牛顿流体假塑性流体，其聚电解质性质在离子强度恒定为0.05 M ，而溶液之pH 由pH 4.0 增加到pH6.5 ，其表面黏度会随pH值的增加而下降，表面黏度也会随溶液之离子强度由0M氯化钠增加至0.1M 氯化钠而急速下降，流体之剪力作用时间之效应在剪速率1000 1/s ，作用时间三十分钟之内并不显著。

(二)分析测定技术方面

1. 去乙酰程度测定

1)改良Niola 等人(1993) 之液相层析法

将离子交换层析管柱改为C8管柱，可使管柱购置成本降低至原来之四分之一，并且较易操作及维护；将水解方法改为真空水解法，可减少层析时所产生之杂峰(游士弘，民88)。

2)改良目前IR 法之缺点

由A1655/A3450 之比值与核磁共振光谱法(nuclearmagnetic resonance, NMR) 所得之N-乙酰化程度之值做回归分析时，可得到一极佳之三次方程式(r =0.9913) 以适用于低乙酰化程度之几丁质产品(游士弘，民88)。

3)建立以超临界流体层析测定之新方法

经酸水解之样品，再添加丁酸做为内标准品，利用超临界流体层析定量水解液中之乙酸，即可求得去乙酰程度(游士弘，民88)。

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